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学习生物信息学的正确态度
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哈佛大学单细胞课程|笔记摘要
为什么是单细胞？
如何获取单细胞原始数据并将其转换为分析所需的矩阵格式
质量控制前的数据准备
质量管理
归一化和主成析
聚类分析和可视化
标记识别和注释
哈佛大学单细胞课程|笔记摘要
单细胞转录组测序进展很快，内容和讲座很多，很多课程很长。像我这样没耐心的孩子只能读完整本——单细胞RNA-seq分析研讨会。
作者谢赫张虎
为什么需要单细胞RNA测序？
在人体组织中，细胞类型、状态和相互作用是高度可变的。为了更好地了解这些组织中存在的细胞类型，单细胞RNA-seq提供了有关单细胞水平表达的基因的信息。
单细胞转录组测序可用于
探索组织中存在哪些细胞类型
识别未知/稀有细胞类型或状况
识别分化过程中或根据时间或状态的基因表达的变化。
识别在不同条件下特定细胞类型中差异表达的基因。
探索细胞类型之间的表达变化，同时整合空间、调控和/或蛋白质组信息。
常见的方法包括
scRNA-seq分析的挑战
在scRNA-seq之前，bulkRNA-seq通常用于转录组分析。BulkRNA-seq是一种直接比较细胞平均表达值的方法，在寻找疾病生物标志物或不考虑样本中大量细胞异质性时可以是方法。
BulkRNA-seq可以探索不同条件下基因表达的差异，但无法完全捕获细胞水平的差异。例如，执行下图中的批量分析无法检测基因A和基因B的表达之间的精确相关性。但是，如果您按细胞类型或细胞状态对细胞进行正确分组，您就可以看到基因之间的正确相关性。
scRNA-seq有一定的局限性，包括样品制备和文库构建的高成本，以及数据分析的复杂性，包括
大量数据
细胞测序深度较低。
细胞/样品之间的技术差异
细胞/样本之间的生物变异性
大量数据
scRNA-seq实验的数据来自捕获的数万甚至数百万个细胞，其测序数据包含数亿个reads，需要更多的内存和存储空间。
细胞测序深度较低。
基于液滴的scRNA-seq方法测序深度较浅，通常只能检测每个细胞10-50%的转录本。注这主要是由于RNA捕获率低。这导致细胞中许多基因的计数为零。然而，特定细胞中的基因计数为零可能意味着该基因不表达或其转录物根本无法检测到。在整个细胞中表达水平较高的基因检测到零值的概率较低。由于这些特征，并非所有基因都可以在任何一种细胞中检测到，并且不同细胞的基因表达差异很大。
零膨胀scRNA-seq数据通常称为零膨胀。然而，最近的分析发现，它包含的零数并不多于考虑到测序深度的预期。
细胞/样本之间的生物变异性
我们不感兴趣的某些生物学差异可能会通过使细胞之间的基因表达比实际的生物细胞类型/状态更加相似/不同来掩盖细胞类型。这些变化包括
转录Burst:并非所有基因都始终打开基因转录。收获时间决定了每个细胞中基因的开启还是关闭。
不同的RNA处理速率不同的RNA以不同的速率处理。
连续或不同的细胞身份（例如，每个单独的T细胞的促炎潜力）根据定义，连续表型在基因表达中是可变的，有时很难将连续表型与不同表型分开。
环境刺激细胞的局部环境可以根据空间位置、信号分子等影响基因表达。
时间变化基本变化的细胞过程，例如细胞周期，可以影响单个细胞的基因表达谱
图片来源Wagner,A,etal单细胞基因组学揭示了细胞身份的载体，NatBiotechnol2016doi:
细胞/样品之间的技术差异
每个细胞的捕获效率
不同的细胞捕获不同数量的转录本，从而导致不同的测序深度。
文库质量
RNA降解、低活力/死亡细胞、大量自由漂浮的RNA和不准确的细胞定量可能会导致质量指标较差。
放大偏差
在文库制备的扩增步骤中，并非所有转录本都会扩增相同的次数。
批量效果
对于scRNA-Seq分析，批次效应是一个重要题。因为出现的任何显着差异表达可能仅仅是由于批次效应造成的。
图片来源HicksSC等人，bioRxiv2015
本文详细记录了因放置不当引起的题。
我如何知道我的实验是否有批次？
所有RNA分离都是在同一天进行的吗？
所有数据库创建都是在同一天完成的吗？
同一个人会对所有样品进行RNA分离/文库制备吗？
所有样品都使用相同的试剂吗？
RNA分离/文库制备是否在同一地点进行？
如果您对上述任何一个题的回为“否”，则您的实验中有一个批次。
部署实践
如果可能的话，避免集体设计实验。
当无法避免时
不要将该实验与批次混淆。
将来自不同样品组的重复样品分成多个批次。
在实验文件的设计中包含批次信息，以便在分析过程中可以补偿批次相关的差异。
提议
在开始实验之前与专家讨论实验设计。
同时，从样品中分离出RNA。
还要准备样品库或备份样品集以避免批次混淆。
不要按性别、年龄或批次混合样品组。
一、实验室使用的细胞株一般是？
1.CHO-K1细胞
CHO-K1细胞是细胞实验中非常常用的细胞系，也广泛应用于生物制药。该细胞系培养条件简单，贴壁适中，转染相对容易，非常适合研究常见哺乳动物基因的功能。
形状表皮细胞
生长特性贴壁
注CHO-K1源自1957年T-T-Puck从成年ZG仓鼠卵巢获得的CHO。
培养基Ham39、sF12K、10x胎牛血清。
传代吸出培养基。用0-25-w/v、Trypsin-0-53mMEDTA洗涤一次去除血清。添加2-3ml胰蛋白酶-EDTA，并置于37C培养箱中约5分钟，直至所有细胞掉落。加入6-8ml培养基，用移液器吹打细胞。将适量的细胞添加到新的培养容器中。
冷冻保存95%培养基+5DMSO液氮冷冻。
2.293个细胞
293细胞相对容易转染，是表达和研究外源基因非常常用的细胞系。293细胞的衍生物293T/17具有更高的转染效率，已成为研究人员研究基因功能的有力工具。293细胞的一个缺点是它们在生长过程中的粘附力相对较低。因此，在实验过程中很容易丢失，影响实验结果。当您从实验室邮寄293个新细胞并将它们放入培养瓶中时，许多细胞会漂浮在培养基中，您需要让它们静置几天。
类型上皮细胞
生长特性贴壁
注这些细胞含有腺病5DNA。
培养基MEM、10%马血清。
传代吸出培养基。用0-25-w/v、Trypsin-0-53mMEDTA洗涤一次去除血清。添加2-3ml胰蛋白酶-EDTA，并置于37C培养箱中约5分钟，直至所有细胞掉落。加入6-8ml培养基，用移液器吹打细胞。将适量的细胞添加到新的培养容器中。
冷冻保存95%培养基+5DMSO液氮冷冻。
3.维罗塞尔
Vero细胞已成功培育出多种疫苗，包括狂犬病疫苗和乙型脑炎疫苗，并在SARS爆发期间为冠状病研究做出了贡献，并广泛应用于医学研究。
类型上皮细胞
生长特性贴壁
注这些细胞是由Y-Yasumura和Y-Kawakita在日本千叶大学于1962年3月27日从正常成年非洲绿猴的肾组织中培养出来的。
培养基MEM、10x胎牛血清
传代吸出培养基。用0-25-w/v、Trypsin-0-53mMEDTA洗涤一次去除血清。添加2-3ml胰蛋白酶-EDTA，并置于37C培养箱中约5分钟，直至所有细胞掉落。加入6-8ml培养基，用移液器吹打细胞。将适量的细胞添加到新的培养容器中。
冷冻保存95%培养基+5DMSO液氮冷冻。
4.NIH-3T3细胞
NIH-3T3细胞通常在细胞实验室中用于转染和基因表达研究。易感病包括鼠肉病和鼠白血病病。
形态成纤维细胞样
生长特性贴壁
注为了获得适合转染的细胞系，NIH-3T3细胞必须连续克隆至少五次。NIH-3T3细胞很容易被DNA转染，并且鼠痘病呈阴性。
培养基DMEM、10%小牛血清
传代吸出培养基。用0-25-w/v、Trypsin-0-53mMEDTA洗涤一次去除血清。添加2-3ml胰蛋白酶-EDTA，并置于37C培养箱中约5分钟，直至所有细胞掉落。加入6-8ml培养基，用移液器吹打细胞。将适量的细胞添加到新的培养容器中。
冷冻保存95%培养基+5DMSO液氮冷冻。
5.PC-12细胞
PC-12细胞是常用的神经元细胞系。
形状多边形细胞
生长特性松散地附着在墙壁上，容易结块
注PC-12细胞系源自可移植的小鼠嗜铬细胞。这些细胞对神经生长因子具有可逆的神经表型反应。细胞不合成肾上腺素。
培养基Ham39；sF12K+15马血清+2-5胎牛血清。
传代吸出培养基。加入新的培养物，用移液器吹出细胞，或者用手敲击培养瓶或将细胞刮入培养物中，用移液器吹出细胞。将适量的细胞添加到新的培养容器中。
冷冻保存95%培养基+5DMSO液氮冷冻。
6.海拉细胞
Hela细胞是所有细胞系中最好的。这句话出自1951年因宫颈去世的美国妇女海伦莱恩(HelenLane)。但来自她的肿的细胞被广泛用于世界各地的实验室。
类型上皮细胞
生长特性贴壁
注HeLa细胞角蛋白免疫沉淀染色呈阳性，包含HPV-18序列，并表达正常水平的pRB和低水平的p53表达。
培养基MEM、10x胎牛血清
传代吸出培养基。用0-25Trypsin-0-53mMEDTA洗涤一次去除血清。添加2-3ml胰蛋白酶-EDTA，并置于37C培养箱中约5分钟，直至所有细胞掉落。加入6-8ml培养基，用移液器吹打细胞。将适量的细胞添加到新的培养容器中。
冷冻保存95%培养基+5DMSO液氮冷冻。
7.SF9细胞
Sf9细胞经常用作杆状病表达系统中的宿主细胞来表达外源蛋白。
类型上皮细胞
生长特性贴壁
注Sf-9细胞是G-E-Smith和CL-Cherry于1983年从细胞系IPLB-SF21AE衍生的克隆。IPLB-SF21AE是Vaughn等人于1977年从草地贪夜蛾蛹的卵巢组织中获得的。
培养基TNM-FH培养基按照厂家说明配制Grace39Anteraea培养基，在1升培养基中加入3-3g酵母粉和3-3g乳白蛋白水解物，用1MKOH调节pH至6-2-。6.过滤-4CJ并储存于4C。使用前在完全培养基中加入10%热灭活胎牛血清。
传代用移液器清洗细胞以重悬细胞，或用手轻敲细胞培养瓶的侧面。如果使用大细胞培养瓶，请重新悬浮细胞。28C孵育。
冷冻保存95%培养基+5DMSO液氮冷冻。
8.BHK21细胞
BHK细胞是指幼年叙利亚仓鼠肾细胞，于1961年建立。原始细胞系是成纤维细胞并且是贴壁依赖性的。1963年获得单细胞克隆。经过多次传代培养后，细胞可以悬浮生长，广泛用于繁殖多种病和生产动物疫苗。最常用的细胞是BHK21的亚克隆，即克隆13或C13。
类型成纤维细胞
生长特性贴壁
注这些细胞来自一天大的新生儿。
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